矮小癥和正常身高兒童的生長激素刺激試驗：免疫功能測定方法的使用
人類GH釋放的晝夜節(jié)律使其難以精確和準確鑒別其分泌不足狀態(tài)。因此，使GH分泌不足的診斷復雜起來，不僅需要評價兒童的身高、體重、生長速度人體測量學變量，而且也要測量生長因子的濃度，并要多次取血樣確定GH的濃度。GH刺激試驗已成為估價矮小癥兒童GH狀態(tài)的標準化處理方法。在大部分兒童，GH刺激試驗也有助于評價GH治療的可能益處。在美國的調(diào)查說明，80%以上的兒科內(nèi)分泌醫(yī)生常規(guī)使用GH刺激試驗。但是，對刺激試驗的正常反應因依賴于所使用的測定方法和以特定方法建立的的標準數(shù)據(jù)問題而難以捉摸。
最初GH刺激試驗的研究以胰島素引起低血糖，后來使用精氨酸為刺激物，早期的研究確立正常兒童的GH峰值至少~5mg/ml，但使用豬MAb抗人GH的GH測定對這個數(shù)值提出了挑戰(zhàn)。單獨或結(jié)合使用其它促分泌素，例如心得安（propranolol）和L-多巴胺、精氨酸和L-多巴胺、氯亞定都得出了不同的結(jié)果。最近，在正常生長的矮小癥兒童大樣本（n=472），對許多不同藥物刺激的GH反應分析研究說明，許多正常兒童未能刺激血清GH濃度，表現(xiàn)出的數(shù)值顯著低于慣例所采用的標準數(shù)值。但是，應用GH釋放激素結(jié)合精氨酸或促生長素抑制素的抑制劑培維索孟（pyridostigmine）時，最小的GH反應也是高的（19ng/ml）。因此這些作者認為，如果不使用如此強大的促分泌素，這些試驗將不能區(qū)別GH分泌充足和不足的兒童。在最近20年內(nèi)，所確定的血清GH濃度峰正常值也有很大的不同，其范圍由5ng/ml至7ng/ml，又到最近10ng/ml。盡管缺乏特定標準值的適當測定方法，但大部分美國內(nèi)分泌醫(yī)生未調(diào)整對刺激試驗結(jié)果的解釋。實際上，在美國調(diào)查的兒科內(nèi)分泌醫(yī)生中，70%以上認為診斷GH分泌不足的GH峰值為<10ng/ml。在研究工作中，大都多次采取血樣來估價GH的分泌方式，但多次采血樣似乎也不如評價為GH充足的刺激結(jié)果更準確。
GH治療已發(fā)展為成年GH分泌不足的替代治療，其目的并非線性生長，也同樣遇到了診斷正常和異常GH狀態(tài)的兩難境地。對于治療成年GH分泌不足病人的醫(yī)生，這是一個特別重要的問題，因為不像在兒童病人那樣有測量身高和生長速度優(yōu)勢。Hoffman et al.證明，有垂體疾病證據(jù)的成年人對胰島素引起低血糖的GH反應峰明顯低于年齡、性別和BMI相匹配的正常受試者，所有正常受試者的GH峰>5ng/ml，所有GH分泌不足受試者<3ng/ml。與24-小時GH濃度譜或IGF-I、IGFBP-3濃度測量相比，胰島素引起的低血糖刺激實驗也有最好的鑒別能力。這些研究和其它的數(shù)據(jù)產(chǎn)生了成年人GH分泌不足的最終試驗推薦意見為，對胰島素引起低血糖的GH反應峰值<3 ng/ml。
最近提出了一種高靈敏性的IFGH測定方法，這種測定方法使用了GH分子在兩個結(jié)合位點上結(jié)合兩種不同受體的概念，使用特異抗GH一個結(jié)合位點的重組GH結(jié)合蛋白（GHBP）和抗另一個結(jié)合位點的MAb，測量GH分子聚合兩受體的能力，因而測量產(chǎn)生生物信號的能力。我們進行本研究，是要觀察新的IFGH測定方法與兩種靈敏的商業(yè)測定方法- DSL ELISA和Hybritech IRMA方法之間的關(guān)系。我們也再次研究了對正常身高兒童使用常規(guī)GH刺激試驗并測量IGF-I、IGFBP-3和酸性不穩(wěn)定亞單位，構(gòu)建GH正常水平的問題。分析了矮身高兒童臨床GH分泌不足的檢查，并與一組正常身高兒童的數(shù)據(jù)進行了比較。
方法
本研究得到維吉尼亞大學Wolfson兒童醫(yī)院臨床研究評審委員會和學會評審委員會的批準。
受試者：在告知并經(jīng)兒童及其父母同意后，作為矮身高（short stature，SS）和生長遲緩評價的一部分，在門診募集了19名兒童（11男，8女），在試驗前不知是否存在GH分泌不足。1名受試者在治療GH分泌不足，身高生長已經(jīng)停止，在做重復刺激試驗。因此，在試驗時其身高SDS并不矮（身高SDS為0.7）。為了比較，也由醫(yī)療中心的職員當中募集了13名健康兒童（5男，8女），都有正常的身高。表1為受試者臨床特征。
研究設計 矮身高兒童使用精氨酸/L-多巴胺或精氨酸/胰島素引起低血糖作為藥物刺激劑進行GH刺激試驗。在每時間點上多取血樣進行如下述的額外測定。在整夜禁食后的清晨，受試者來到Wolfson兒童醫(yī)院臨床研究中心或維吉尼亞大學臨床研究中心，在應用麻醉劑霜后，抽取血樣用于測定幾種激素。然后立即口服L-多巴胺（依體重不同，250或500mg），以0.5g/kg的劑量進行10%鹽酸精氨酸30分鐘的輸液，在0，20，40，60，90和120分鐘取血樣用于測定GH濃度。并測量同一時間點的血漿IGF-I、IGFBP-3和ALS。采用精氨酸/胰島素引起低血糖試驗的病人（n=6）在取樣60分鐘后，接受0.075 U/kg的胰島素，在120分鐘試驗過程中多次采集血樣。在血漿葡萄糖濃度<40mg%時為血糖過低，僅1名受試者出現(xiàn)了胰島素引起的血糖過低。正常對照組兒童都采用精氨酸/L-多巴胺試驗。
測定 使用DSL ELISA方法測定GH濃度。該方法是一種酶增雙抗夾心免疫測定，使用單克隆抗人-GH抗體，靈敏度為0.03ng/ml，測定批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV）分別為4%和6%。使用世界衛(wèi)生組織標準（88/624）校對測定標準。
此外，使用以前提出的DSL IFGH方法測定GH分子在兩個不同結(jié)合位點結(jié)合能力的GH濃度。這種測定方法使用MAb抗GH分子結(jié)合位點2，以?；亟MGHBP結(jié)合GH的結(jié)合位點1。在孵化和洗滌后，以?；亟MGHBP孵化管壁，通過添加抗生蛋白鏈霉素標記的辣根過氧化物酶捕獲GH分子的結(jié)合位點。因此測量的吸光度直接與占據(jù)兩個GH受體結(jié)合位點的有生物活性的完整GH濃度成比例，批內(nèi)和批間CV分別為3-5%和4-9%。依照WHO 88/624校對標準。
所有SS組的病人也都以IRMA方法測量GH濃度。測定使用兩種抗GH分子兩位點的MAb，靈敏度為0.2ng/ml，批內(nèi)和批間CV分別為3-4%和3-5%。正常對照組也以這種測定方法進行分析。標準使用國家衛(wèi)生研究所GH參照制劑HS2243E。
血漿IGF-I、IGFBP-3和ALS濃度使用DSL商業(yè)ELISA方法測量。
統(tǒng)計分析 使用參數(shù)t 檢驗分析兩組所有測量生長因子的差異。使用多元逐步回歸分析估價GH測定方法與其它生長因子和人體側(cè)學指標的關(guān)系，顯著性水平為 p<0.05。
結(jié)果
表2列出了本研究受試者的生長因子和三種不同方法測定的GH濃度，并與正常對照組進行了比較。無論使用免疫功能方法還是DSL ELISA方法,SS組的血清GH濃度相似，然而Hybritech測定方法始終較高。不管測定方法如何，組內(nèi)GH峰值高度相關(guān)（圖1）。SS組與對照組之間，每種方法測定的GH濃度（峰值或平均數(shù)）差異均無統(tǒng)計學顯著性，但IFGH對DSL ELISA GH的曲線斜率（0.98）明顯大于DSL ELISA GH對Hybritech IRMA GH（0.68）或IFGH對Hybritech GH的斜率（0.65），說明Hybritech IRMA方法測定的GH分子與DSL ELISA和IFGH方法不同。有趣的是，正常對照組測定的GH濃度范圍寬大，在13名兒童中，應用不同測定方法測定的GH峰值<7ng/ml的兒童例數(shù)不同，使用IFGH方法有11名，使用DSL ELISA方法有6名，在使用常規(guī)Hybritech IRMA方法的9名兒童中有4名。實際上，在13名正常身高兒童中，使用常規(guī)DSL ELISA方法有46%的或6名兒童的GH水平<5ng/ml，使用Hybritech IRMA方法的9名兒童中有3名（33%）GH水平<5ng/ml（圖2）。這些數(shù)據(jù)范圍是在青春期前和青春期少年受試者所觀察到的。在以胰島素引起低血糖刺激試驗的受試者也同樣觀察到了較低的GH峰值。
但是，SS組的血漿IGF-I、IGFBP-3、ALS的實際濃度或SDS始終低于對照組，甚至在將小于6歲的4名兒童排除后，這種差異依然存在。
在SS組進行多元回歸分析以評價對刺激試驗GH反應峰值（IFGH和ELISA方法）之間的關(guān)系，分析數(shù)據(jù)列于表3。在IFGH或ELISA的GH濃度峰值與血漿IGF-I、IGFBP-3、ALS濃度之間，在IFGH或ELISA GH濃度與身高SDS、BMI、生活年齡、線性生長速度之間的相關(guān)均無統(tǒng)計學顯著性。
討論
研究表明，SS組和正常兒童組IFGH方法與常規(guī)方法測定的GH高度相關(guān)，即使IRMA方法對矮身高兒童的測定值始終較高，但DSL ELISA和Hybritech IRMA方法相互之間以及與IFGH測定方法密切相關(guān)。這些數(shù)據(jù)提示，在所研究的大部分受試者中IFGH測定方法并不比ELISA方法優(yōu)越很多，說明所檢驗的測定方法（標準的DSL ELISA或Hybritech IRMA方法）能夠準確檢測生物活性分子。
以前曾經(jīng)報告SS由GH無生物學活性所引起，以高循環(huán)GH濃度為特征，缺乏GH作用，在給外源性GH后出現(xiàn)顯著的趕上生長。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種狀況與GH-1基因突變有關(guān)，GH基因突變不僅不能刺激酪氨酸的磷酸化，而且還具有拮抗作用。確定是否存在免疫功能/免疫測定濃度比例異常的特發(fā)性SS病人（提示GH無生物活性），可能還需要以這兩種測定方法在其它方面正常的特發(fā)性SS兒童大樣本中進一步的研究。
本文所研究的正常身高的兒童使用了精氨酸與L-多巴胺或精氨酸與胰島素引起低血糖刺激GH分泌，許多兒童對刺激的GH反應峰值低于慣例認可的界值點，使用DSL ELISA 或Hybritech IRMA方法測定，約50%的正常兒童峰值<7ng/ml，33-46%的兒童（使用Hybritech IRMA或DSL ELISA測定方法)低于5ng/ml。事實上，兩名青春期發(fā)育完全正常的受試者GH濃度峰值在2ng/ml（使用IFGH和DSL ELISA GH方法）。總之，本研究和其它研究數(shù)據(jù)支持兒童GH刺激試驗不能準確確定分泌不足的觀點，除非GH水平很低（2ng/ml），使用通用的促分泌素和當代靈敏性的測定方法評價矮身高兒童時，武斷的10、7、5ng/ml界值點無應用價值。但是，如果使用更強力的刺激（例如GH釋放激素和培維索孟）能夠較好地區(qū)分分泌不足和充足。
另一方面，循環(huán)生長因子測量表現(xiàn)出有趣的趨勢。甚至在排除SS組小年齡兒童進行分析時，SS組的IGF-I、IGFBP-3、ALS濃度總體上低于正常對照組。因為所有這些肽類都有GH依賴性，所以正常兒童的濃度明顯高于SS組的事實說明，測定這些生長因子可能比GH刺激試驗更能夠鑒別兒童GH分泌不足，這種原則得到了其它研究的支持。
使用3種方法測定的刺激實驗GH反應峰值與普遍使用的身高、BMI、年齡、生長速度、IGF-I、IGFBP-3、ALS等人體側(cè)學指標之間無相關(guān)，使其難以更好地預測GH治療時的線性生長潛力。
據(jù)估計，美國42%的GH治療兒童無典型的GH分泌不足，但是，其中有許多特發(fā)性SS兒童，GH增加線性生長和最終身高的效果確實不那么顯著。因此，確立正確診斷兒童GH分泌不足的標準所節(jié)約的財力是大量的。其它方面正常，IGF-I、IGFBP-3和ALS濃度正常而在5%百分位數(shù)上生長的SS兒童不需要GH刺激試驗，無CNS癥狀時也不需要后來的腦部磁共振成像。對于有低濃度循環(huán)生長因子和生長不良的兒童才應當進行GH刺激試驗。
總之，在矮身高兒童GH刺激試驗中使用新的IFGH測定方法與標準的GH DSL ELISA 和Hybritech IRMA方法高度相關(guān)，提示這些當代GH免疫測定方法大都能夠檢測產(chǎn)生的生物學信號。我們也證明，正常身高兒童GH濃度的增長可能達不到2ng/ml以上，而卻有正常的依賴GH的生長因子循環(huán)水平。這些數(shù)據(jù)也說明，對通用刺激的GH反應峰值的異常標準是否是10、7、或是5ng/ml，仍然有待于研究。
我們結(jié)論為，正常GH刺激試驗結(jié)果可能比以往公認的數(shù)值低許多。依賴GH的生長因子可能是比刺激的GH濃度更敏感的GH分泌不足指征。
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